Trasa Jižní stezky prochází jižním okrajem Českomoravské vrchoviny od východu k západu, poblíž státní hranice s Rakouskem. Na území Vysočiny vstupuje západně od Šatova a dostává se nejprve do podoblasti Jevišovické pahorkatiny. V tomto úseku Jižní stezka sleduje hluboké údolí Dyje s atraktivní krajinou národního parku Podyjí. Za Dešnou vstupuje trasa do Křižanovské vrchoviny, prochází údolím Moravské Dyje a přes vrch a poutní místo Montserrat se dostává do Slavonic. V posledním úseku za Slavonicemi vstupuje Jižní stezka z Moravy na historické území Čech, přechází Javořickou vrchovinu a dostává se do oblasti České Kanady. Tady také Jižní stezka dosahuje svého nejvyššího bodu na Vysočině, kterým je jižní úbočí Jeleního vrchu nedaleko Landštejna (697 metrů). Celý úsek Českomoravskou vrchovinou měří 138 kilometrů a je rozdělen na 6 celodenních etap.
Cyklistická varianta
Cyklistická varianta Jižní stezky přes Českomoravskou vrchovinu sleduje v hrubých obrysech pěší trasu. Výjimkou jsou pro kola nevhodné nebo zakázané úseky v národním parku Podyjí (například Pašerácká stezka přes Obelisk), trasa objíždí rovněž pro kola těžko průjezdný úsek po zelené značce u Lubnice nebo technicky náročnou pasáž mezi Janovem a vrchem Montserrat. Za Slavonicemi se cyklistická trasa vydává přes Maříž k trojmeznému hraničnímu kameni a objíždí tak velmi turisticky živý červeně značený úsek mezi Slavonicemi a Starým Městem pod Landštejnem. V okolí Nové Bystřice se pak cyklistická varianta vyhýbá většině Graselových stezek a volí přímější cestu po značených cyklotrasách. V posledním úseku z Peršláku do Staňkova směřuje cyklistická varianta Jižní stezky po značených cyklotrasách a vyhýbá se tak pěším cestám i neznačenému úseku přes Schullerův kámen. Celý úsek přes Českomoravskou vysočinu je dlouhý 132 kilometrů a dá se ujet za 2–3 dny, pro třídenní přejezd jsou ideálními nocovišti Bítov a Slavonice.